將克(ke)隆化基(ji)因插入(ru)合適載體后導入(ru)大(da)(da)(da)腸(chang)桿菌用于(yu)表(biao)達大(da)(da)(da)量蛋白質的方法一般稱(cheng)為原核表(biao)達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析(xi)等(deng)方面都有應用。大(da)(da)(da)腸(chang)桿菌用于(yu)表(biao)達重組蛋白有以下特點：

易于生長(chang)和控制(zhi)；用于細(xi)菌(jun)培養的(de)材料不及哺乳(ru)動物細(xi)胞系統的(de)材料昂(ang)貴；有各種各樣的(de)大腸(chang)桿菌(jun)菌(jun)株及與之(zhi)匹配的(de)具各種特(te)性(xing)的(de)質(zhi)粒可供選擇。但是，在(zai)大腸(chang)桿菌(jun)中表達(da)的(de)蛋(dan)白由(you)于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后(hou)加工，常形(xing)成包涵體而影(ying)響表達(da)蛋(dan)白的(de)生物學活(huo)性(xing)及構(gou)象(xiang)。

表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件：

（1）選(xuan)擇標志的編碼序列；

（2）可控轉(zhuan)錄的啟動子；

（3）轉錄調控序列(轉錄終止子，核糖體結合位點)；

（4）一個(ge)多限(xian)制酶切位點接(jie)頭；

（5）宿主(zhu)體內自主(zhu)復制的序列。

原核表達一般程序如下：

獲(huo)得目的(de)(de)基因－準備(bei)表(biao)達(da)載(zai)體－將目的(de)(de)基因插入表(biao)達(da)載(zai)體中（測序(xu)驗證(zheng)）－轉(zhuan)化表(biao)達(da)宿(su)主菌－誘導靶(ba)蛋(dan)白的(de)(de)表(biao)達(da)－表(biao)達(da)蛋(dan)白的(de)(de)分析－擴增、純化、進一步檢測

一、試劑準備

1、LB培養基。

2、100mM IPTG（異丙基硫代-β-D^-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH₂O中，0.22μm濾(lv)膜抽濾(lv)，-20℃保存。

二、操作步驟

（一）獲得目的基因

1、通過PCR方法：以含目(mu)的(de)基(ji)(ji)因的(de)克隆質粒為模板，按基(ji)(ji)因序列設計一對引(yin)(yin)物（在上游和(he)下游引(yin)(yin)物分別(bie)引(yin)(yin)入不同的(de)酶(mei)切(qie)位點），PCR循(xun)環獲得所需基(ji)(ji)因片段。

2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以(yi)mRNA為模(mo)板，逆(ni)(ni)轉錄形(xing)成(cheng)cDNA第yi鏈，以(yi)逆(ni)(ni)轉錄產物為模(mo)板進行PCR循環獲得(de)產物。

（二(er)）構建重組表(biao)達載體

1、載體(ti)酶(mei)切：將(jiang)表達質粒用限制性(xing)內切酶(mei)（同引物(wu)的酶(mei)切位點）進行(xing)(xing)雙酶(mei)切，酶(mei)切產物(wu)行(xing)(xing)瓊脂糖電泳后，用膠(jiao)回收(shou)Kit或凍融法回收(shou)載體(ti)大片(pian)段。

2、PCR產物雙酶(mei)切(qie)后(hou)回收，在T4DNA連(lian)接(jie)酶(mei)作(zuo)用下連(lian)接(jie)入(ru)載體。

（三）獲(huo)得含重組表(biao)達(da)質粒的表(biao)達(da)菌種

1、將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，根(gen)據重組載體的標(biao)志（抗Amp或藍白斑）作篩(shai)選，挑取單(dan)斑，堿(jian)裂(lie)解(jie)法(fa)小量抽提質粒(li)，雙酶切初步鑒定。

2、測序驗證目的基因的插入(ru)方向(xiang)及閱讀(du)框架均正確(que)，進入(ru)下(xia)步操作(zuo)。否則應篩(shai)選更(geng)多克(ke)(ke)隆，重復(fu)亞(ya)克(ke)(ke)隆或(huo)亞(ya)克(ke)(ke)隆至不(bu)同酶切位點。

3、以此重組質粒DNA轉化(hua)表達宿(su)主菌的感受態細胞。

（四）誘導表達

1、挑取含重組質(zhi)粒(li)的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃過(guo)夜培養。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中，37℃震蕩培養至OD₆₀₀ ≌0.4-1.0（OD600 0.6，大約需3hr）。

3、取部分液體作為未(wei)誘導的對照組(zu)，余下的加入IPTG誘導劑至(zhi)終濃度0.4mM作為實(shi)驗組(zu)，兩組(zu)繼續37℃震蕩培(pei)養3hr。

4、分(fen)別取(qu)菌體1ml，離(li)心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸(xuan)，混(hun)勻，70℃10min。

5、離心(xin)12000g×1min，取上清作為樣(yang)品，可(ke)做SDS-PAGE等分析。

三、注意事項

1、選擇(ze)表達載體時，要根(gen)據所表達蛋白(bai)的終(zhong)應用(yong)考(kao)慮。如為方(fang)便(bian)純化(hua)，可選擇(ze)融(rong)合表達；如為獲得天然蛋白(bai)，可選擇(ze)非融(rong)合表達。

2、融合表達(da)時在選擇外(wai)源DNA同載(zai)體(ti)分子連接反應時，對轉錄和轉譯過程(cheng)中密(mi)碼結構(gou)的閱讀不能發(fa)生干擾。